对除莠剂敏感的植物或植物细胞进行转化的方法
2020-01-08

对除莠剂敏感的植物或植物细胞进行转化的方法

公开了一种编码抗除莠剂的植物乙酰乳酸合酶蛋白的核酸片段。此核酸片段至少含有一个核苷酸突变,该突变在乙酰乳酸合酶的七个基本上是保守的氨基酸同源区的一个中导致一个氨基酸的变化。此突变产生的乙酰乳酸合酶蛋白与野生型蛋白相比对磺酰脲除莠剂具有抗性。用此片段转化除莠剂敏感性植物或植物细胞产生对除莠剂的抗性。

为进行植物细胞转化,应用了标准的无菌技术、无菌培养基和无污染的植物/细菌培养物,并在所有转移中使用了层流通风橱。实例6中给出了培养基配方。用于叶圆片感染实验的盆栽烟草植株种在白昼12小时,24℃,夜晚12小时,20℃,相对湿度大约为80%,冷白荧光和白炽光混合光照的生长室中。基本上按照Horsch et al.(1985)Science 227:1229的方法进行烟草叶圆片感染。

每次溶解一种,完全溶解后加入下一种。

虽然,位置121、122、197、205、256、359、384、588、591和595处的氨基酸残基,在迄今从真核生物中鉴定出的所有野生型除莠剂敏感性ALS酶中都是保守的,但在野生细菌的ALS酶的这些位置发现了一些置换。大肠杆菌同功酶I在位置122处有一个丝氨酸而不是丙氨酸,在位置591处有一个谷氨酰胺而不是色氨酸,大肠杆菌同功酶II在位置197处有一个丝氨酸而不是脯氨酸,大肠杆菌同功酶III在位置197有一个丙氨酸而不是脯氨酸,在位置595有一个异亮氨酸而不是苯丙氨酸。每一种这些大肠杆菌ALS同功酶都比植物或酵母ALS对(尤其是)磺酰脲除莠剂的抑制有更强的抗性(从50倍至大于10,000倍)。而且,在大肠杆菌ALS II中,导致在位置197的丝氨酸至脯氨酸置换的定位突变,使突变型酶对抑制的敏感性增加100倍,就是说,和野生型高等植物酶对抑制的敏感性相同。因此,大肠杆菌ALS II中位置197的脯氨酸与酵母和高等植物ALS中的一样参与除莠剂结合。

e)核酸片段在位置256编码一个不是赖氨酸的氨基酸。优选的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸或苯丙氨酸。最好的氨基酸是甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺或色氨酸。

在有或没有除莠剂的情况下,测定转化或未转化植株ALS活性的方法如下:1.在组织匀浆器中粉碎2.5g相对幼小的叶组织(4-6时长),其中含有10ml提取缓冲液(100mM KHPO4pH7.5,0.5M MgCl2,10%甘油,1mM丙酮酸,0.5mM TPP,10nM FAD)和200mg Polyclar AT(BDH Biochemi-cals公司)。保存在冰上。

用解剖刀从大约4-6周龄的烟草植株(Nicotiana taba-cum cv.NK 326或K 14)上,收集长约4-6时未完全展开的幼叶。将叶片浸入大约500ml 10%Chlorox,0.1%SDS溶液中进行表面消毒30分钟,然后用无菌的去离子水洗涤3次。用无菌的纸打孔器从完整叶片上制取直径6mm的叶圆片。

外植体收集入25×100mm培养皿中,其中有含500μg/mlcefotaxime的液态PG 0.1/0.1,在旋转摇床上以40rpm轻轻摇动1小时。倾倒出培养液,用新鲜的反选择性培养基取代,再轻轻摇动2小时。外植体以格网状置于平皿上,每个100mm含有500μg/ml cefotaxime的琼脂固化的PG 0.1/0.1平皿上放25个外植体,并于24℃下培养3天。

磺酰脲U.S.4,127,405     U.S.4,383,113U.S.4,169,719     U.S.4,394,153U.S.4,190,432     U.S.4,394,506U.S.4,214,890     U.S.4,420,325U.S.4,225,337     U.S.4,452,628U.S.4,231,784     U.S.4,481,029U.S.4,257,802     U.S.4,566,950U.S.4,310,346     U.S.4,435,206U.S.4,544,401     U.S.4,514,222U.S.4,435,206     U.S.4,634,465EP-A-204,513三唑嘧啶磺胺南非申请84/8844(85.5.14.出版)咪唑啉酮US4,188,487EP-A-41,623(81.12.16.出版)本发明的核酸片段编码的ALS抗下列磺酰脲除莠剂及它们的适于农业使用的盐类:b)如果Y是OCF2H,则Z是CH;c)如果J是J-1,R1是OSO2R12或苯基,则Y不是OCF2H;d)如果J是J-2,则Y不是OCF2H或OCH2CF3;e)如果J是J-3,R4是S(O)mR12,则Y不是OCH2CF3。</claim><claim>132.根据权利要求131的方法,其中J是J-1;R1是Cl,CH3,C1-C4烷氧基,C1-C2卤代烷氧基,烯丙氧基,炔丙氧基,CO2R9,CONR10R11,SO2N(OCH3)CH3,SO2NR10R11,S(O)mR12,OSO2R12,苯基或

表1.GVKNT13感染的烟草愈伤组织的测定结果转化的苗分离块在选择和非选择培养基上生成的愈伤组织数目GVKNT131GVKK2GV38503实验1无选择            59/62      12/13      10/10卡那霉素(50mg/L)  53/62       8/13       0/10CS(10ppb)          0/62       0/13       0/10实验2无选择            96/102     21/23      22/25卡那霉素(50mg/L)  81/102     16/23       0/25CS(10ppb)          0/102      0/23       0/25

首先去掉种皮极大地方便了种子的表面灭菌。然后使种子在70%乙醇中洗涤2分钟灭菌,再在Clorox/Tween(见实例7)中洗涤20分钟。无菌种子用无菌蒸馏水洗3次,使其在OMS上于24℃下发芽,给以16小时的白昼长度。

本发明提供了一组特殊的核酸片段,将它们导入除莠剂敏感的植物中会赋予该植物除莠剂抗性。这里所说的“核酸片段”是指单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的线性片段,它们可从任何来源产生。本发明的核酸片段最好是DNA片段。名词“植物”是指一种光合生物,包括藻类、苔藓类、蕨类、裸子植物和被子植物。但此名词不包括原核和真核微生物如细菌、酵母和真菌。“植物细胞”包括任何从植物产生的细胞,包括未分化的组织如愈伤组织或冠瘿瘤,以及原生质体、胚胎和配子细胞。名词“植物乙酰乳酸合酶”是指在植物或植物细胞中表达的特定酶。名词“核苷酸序列是指DNA或RNA的聚合物,它可以是单链或双链的,含有或不含有合成的、非天然的或可以掺合进DNA或RNA聚合物中去的修饰核苷酸。这里所用的“基本上是保守的氨基酸序列”是指不同来源ALS酶的多肽间的氨基酸同源区。在本发明中,有7个基本上是保守的氨基酸序列示于图6中,它们分别称为A、B、C、D、E、F和G。技术熟练的人能够将不同来源的ALS酶的氨基酸序列根据图6所示排列起来,从中鉴别出那些此处定义为基本上是保守的氨基酸序列的片段。然后,技术熟练的人能够确定鉴别出的片段是否具有本申请所公开并要求保护的特性。应当认为,这种表述包括对ALS酶的活性不产生不利影响的片段修饰。术语“核酸构建体”是指质粒、病毒、自我复制序列、噬菌体或者单链或双链DNA或RNA的线性片段,它们可从任何来源产生,并能够将核酸片段导入生物细胞中。